猴痘病毒實驗室檢測技術指南
發布時間：2023年07月27日
來源：國家疾控局 閱讀次數：
為指導各級疾控部門和其他相關機構規范開展猴痘病毒實驗室檢測工作，快速、準確識別猴痘確診病例，制定本指南。本指南主要介紹標本采集以及猴痘病毒核酸熒光定量PCR檢測方法、生物安全要求等內容。 ?。ㄒ唬┎蓸尤藛T。從事猴痘病毒核酸檢測標本采集的技術人員應當經過生物安全培訓，培訓合格后方可從事采樣工作。采樣人員應熟悉采集標本種類和采集方法，熟練掌握標本采集操作流程及注意事項，做好標本信息記錄，確保標本質量符合要求、標本及相關信息可追溯。 1.采樣人員個人防護裝備要求：KN95/N95及以上級別的口罩、防護面屏或護目鏡、一次性隔離衣、一次性乳膠手套（盡可能戴兩層）、靴套；如果接觸了病例血液、體液、分泌物或排泄物，應及時更換手套。污水采樣人員可根據實際工作需要，適當降低防護級別。 2.住院病例的標本由所在醫院醫護人員采集，根據實驗室檢測工作的需要，可結合病程多次采樣。 3.密切接觸者標本由當地疾控機構或醫療機構專業人員采集。 4.感染或疑似感染猴痘病毒的動物由當地疾控機構協調動物疫控部門專業采樣人員負責采集。 5.環境或其它生物材料標本由相關專業采樣人員負責采集。 ?。ǘz測人員。實驗室檢測技術人員應具備相關專業大專以上學歷或具有中級及以上專業技術資格，并有2年以上實驗室工作經歷，接受過核酸檢測相關培訓，培訓合格后方可從事檢測工作。實驗室配備的工作人員數量應與所開展檢測項目及標本量相適宜，確保能夠及時、熟練、準確地開展實驗室檢測和報告結果。 1.首選標本是皮膚（黏膜）病變部位標本，包括病變表面拭子、痘皰液或痘皰滲出物拭子、痘痂或痘痂拭子等。 2.呼吸道標本，如口咽拭子，可用于病例急性期檢測，也是密切接觸者檢測最常用標本。 3.發病急性期可采集EDTA抗凝血標本進行核酸檢測。 4.采集發病后7天內（急性期）、3-4周后（恢復期）雙份血清用于抗體檢測。 5.直腸拭子、尿液、精液、唾液等其它標本僅用于研究，根據工作需要采集。 6.污水或其它環境生物材料標本根據實際工作需要進行采集。 采集皮膚（黏膜）病變部位標本時應使用無菌聚酯纖維、尼龍或類似材質拭子，避免使用棉拭子。采集疑似病例的標本前應避免使用75%乙醇等消毒劑清潔病變部位。每種類型的皮膚（黏膜）病變應盡可能采集兩個以上拭子，每個病例應同時采集身體不同部位或外觀不同的2-3種病變標本。采集皮膚（黏膜）病變部位標本時應適當用力。皮膚（黏膜）病變部位、痘痂或分泌物等不同拭子標本應放置于不同的采樣管中。進行病毒分離時應采集干拭子標本（無采樣液）或以非滅活型病毒采樣液保存。根據實驗室活動資質確定使用非滅活型或滅活型采樣液采集標本。 1.斑疹、丘疹、水皰或膿皰等皮膚（黏膜）病變部位標本：一手緊握采樣拭子尾部，手與拭子頭部保持一寸以上距離。采樣時適當用力下壓拭子，在皮損表面來回擦拭至少2-3次，然后以拭子另一面再重復擦拭2-3次。如果在擦拭過程中痘皰破裂，要確保采集到痘皰液。采樣后將拭子放置于無菌采樣管中（可含病毒采樣液或不含液體），折斷拭子頭，去除拭子尾部，蓋上管蓋，以消毒紙巾擦拭消毒采樣管，以封口膜密封管蓋后將采樣管保存或送檢。 2.痘痂或痘皰皮膚（黏膜）標本：采樣前應確保實驗室可檢測此類標本。使用無菌鑷子或其他鈍頭器械夾取全部痘痂或面積至少4mm×4mm大小的痂皮，放置于干燥、無菌的采樣管中，采樣完成后以創可貼覆蓋患處。 3.口咽拭子標本：被采集人員頭部微仰，嘴張大，露出兩側扁桃體，將拭子越過舌根，在被采集者兩側扁桃體稍微用力來回擦拭至少3次，然后再在咽后壁上下擦拭至少3次，將拭子頭浸入含2-3mL病毒保存液的管中或置于不含液體（干拭子）的無菌管中，尾部棄去，旋緊管蓋。 4.血液標本：盡量采集急性期（發病7天內）的血液標本，建議使用含EDTA抗凝劑的真空采血管采集5mL全血，可利用全血進行檢測，或室溫靜置30分鐘后，1500-2000rpm離心10分鐘，收集血漿于無菌管中進行檢測。 5.血清標本：用真空負壓采血管采集血液標本5mL，室溫靜置30分鐘，1500-2000rpm離心10分鐘，收集血清于無菌螺口塑料管中。第一份血清應盡早（最好在發病后7天內）釆集，第二份血清應在發病后第3-4周采集，采集血液標本5mL后室溫靜置30分鐘，1500-2000rpm離心10分鐘，收集血清于無菌螺口塑料管中，用于猴痘抗體檢測。 標本應在收集后1小時內冷藏（2-8℃）或冷凍（-20℃或以下），并盡快進行檢測?？稍?周內檢測的標本可置于4℃環境中保存；1周內無法檢測的標本，短期可置于-20℃環境中保存，長期應置于-70℃或以下環境中保存。全血分離血漿前冷藏（2-8℃），分離出的血漿置于-20℃或以下環境中保存。應設立專庫或專柜單獨保存標本，避免反復凍融標本。 猴痘病毒及其相關標本應由專人管理，準確記錄病毒及標本的來源、編號、數量等信息，具體要求可參考《病原微生物菌（毒）種保藏數據描述通則》（T/CPMA 011-2020）。應采取有效措施確保病毒及標本安全，嚴防發生誤用、惡意使用、被盜、被搶、丟失、泄露等事件。 標本采集后應盡快在低溫條件下（冰袋或干冰）送往實驗室，如需長途運輸標本，應采用干冰冷凍運輸方式進行保藏。 1.送檢標本：病例標本先由省級及以下疾控機構進行初步檢測，各省首例猴痘陽性標本應送中國疾控中心病毒病所復核。每個陽性病例至少采集一套標本（皮膚或黏膜病變部位標本、口咽拭子標本及急性期、恢復期雙份血清標本）送中國疾控中心病毒病所檢測。各省級疾控機構根據實際情況制定省內樣本送檢、復核流程。 ?。?）國內運輸。猴痘病毒或其他潛在感染性生物材料的運輸包裝分類屬于A類，對應的聯合國編號為UN2814，包裝符合國際民航組織文件Doc9284《危險品航空安全運輸技術細則》的PI602分類包裝要求，通過其他交通工具運輸的可參照以上標準包裝。猴痘病毒或其他潛在感染性材料運輸應按照《可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運輸管理規定》（原衛生部令第45號）辦理《準運證書》。污水等環境標本暫按普通生物樣本運輸標準執行。 ?。?）國際運輸。猴痘毒株或樣本在國際間運輸的，應規范包裝，按照《出入境特殊物品衛生檢疫管理規定》辦理相關手續，并滿足相關國家和國際相關要求。 開展猴痘病毒核酸檢測的實驗室，應當符合《病原微生物實驗室生物安全管理條例》（國務院令第424號）或《醫療機構臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法》（衛辦醫政發〔2010〕194號）有關規定，具備設區的市級衛生健康部門備案的生物安全二級（BSL-2）實驗室及以上實驗室條件，并備案猴痘病毒相關實驗活動。獨立設置的醫學檢驗實驗室還應符合《醫學檢驗實驗室基本標準（試行）》《醫學檢驗實驗室管理規范（試行）》等要求。 開展猴痘病毒分離、培養、中和等涉及病毒擴增、使用等實驗操作的實驗室應具備國家衛生健康委批準的生物安全三級（BSL-3）實驗室及以上實驗室條件，且獲得猴痘病毒實驗活動批準。分離的猴痘病毒應送國家病原微生物保藏中心/國家病原微生物資源庫病毒分庫保藏。 根據2006年公布實施的《人間傳染的病原微生物名錄》（簡稱《名錄》），猴痘病毒生物危害分類為第一類，是一種高致病性病毒。按照《名錄》要求，猴痘病毒的分離、培養等涉及病毒擴增及使用的實驗操作需在BSL-3及以上實驗室的生物安全柜內進行；非滅活采樣液采集的猴痘病例樣本的滅活在BSL-3實驗室進行；樣本滅活后猴痘病毒DNA提取、檢測可在BSL-2及以上實驗室或PCR檢測的專門區域或房間進行。如《名錄》更新，開展猴痘病毒操作的實驗室生物安全要求應按最新《名錄》執行。污水樣本的滅活參照普通生物樣本。 原則上開展猴痘病毒核酸檢測的實驗室應當設置以下區域：試劑儲存和準備區、標本制備區、擴增和產物分析區。三個區域在物理空間上應完全相互獨立，空氣應定向流通。各區功能分別是： 1.試劑儲存和準備區：貯存試劑的制備、試劑的分裝和擴增反應混合液的制備，以及離心管、吸頭等消耗品的貯存和準備。 2.標本制備區：轉運桶開啟、標本滅活，核酸提取及加入至擴增反應管等。 根據使用儀器的功能，區域可適當合并。如采用標本處理、核酸提取及擴增檢測為一體的自動化分析儀，標本制備區、擴增和產物分析區可合并。 實驗室應當配備與開展檢驗項目相適宜的儀器設備，包括：二級生物安全柜、高速臺式離心機、干浴恒溫器、熒光定量PCR儀、計時器、移液器。 實驗室接到標本后，按照標準操作程序進行試劑準備、標本前處理、核酸提取、核酸擴增、結果分析及報告。實驗室應當建立可疑標本和陽性標本復檢流程。 ?。?）標本：包括病變表面拭子、痘皰液或痘皰滲出液拭子、痘痂或痘痂拭子、咽拭子、全血或血漿等標本。 ?。?）核酸提取試劑盒（基因組DNA提取試劑盒）：組織基因組DNA提取試劑盒或血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒。 ?、僭噭篋NA聚合酶或預混的PCR反應試劑（PCR Master Mix）。
?、?5%乙醇：用于手部和物體表面常規消毒，開啟后有效期為1周。 ?、诤认疽海含F用現配，含有效氯1000mg/L的消毒液用于物體表面常規消毒，含有效氯5000mg/L的消毒液用于感染性材料溢灑時的應急處理。 ?。?）耗材：包括帶濾芯的吸頭、螺旋口的離心管、非螺旋口的離心管、含鋯珠的粉碎管、PCR反應板和透明封膜或PCR反應管和透明蓋。 ?。?）BSL-2個人防護用品：包括KN95/N95口罩及以上級別的口罩、一次性隔離衣、防護眼罩或面屏、一次性帽子、鞋套、靴套和手套。 ?。?）核對被檢標本編號、姓名、性別、年齡及檢測項目； ?。?）待檢標本長期存放在-70℃，短期存放可在-20℃，避免反復凍融。 操作方法按DNA提取試劑盒相應說明書進行操作，具體如下： ?、偬崛≡噭蕚洌旱谝淮伍_啟試劑盒，在使用前先在漂洗液中加入無水乙醇，加入體積參照瓶上標簽。所有試劑在使用前應平衡至室溫；所有離心步驟應在室溫下進行。 ?、谔幚順颖荆?/section> A.痘皰液：干拭子標本需以適當體積的含PS的PBS或DMEM重懸后檢測。取100μL樣本，加入80μL緩沖液，總量為180μL；標本體積不足100μL時用緩沖液補足總體積至180μL； B.病變皮疹或痘痂：取1塊痂皮按質量/體積（1mg/50μL）加入相應體積含PS的PBS，研磨或勻漿處理，取80μL，然后加入100μL緩沖液； C.咽拭子、其它拭子：從采樣液中取200μL標本，干拭子標本可用3mL含PS的PBS或DMEM重懸，混勻后取200μL； ?、奂尤?0μL蛋白酶K溶液，混勻，溶液會變清亮。若樣本為病變皮疹或其它組織時，加入蛋白酶K混勻后，在56℃放置，直至組織溶解，再進行下一步驟。 ?、芗尤?00μL裂解緩沖液，充分混勻，70℃放置10分鐘，或至溶液變清亮，簡短離心以去除管蓋內壁水珠。 需注意：加入裂解緩沖液后可能會出現白色絮狀沉淀，在70℃放置后會消失。如溶液未變清亮，說明細胞裂解不徹底，可能導致提取DNA量少或提取出的DNA不純。 ?、菁?00μL無水乙醇，充分混勻，此時可能會出現絮狀沉淀，簡短離心以去除管蓋內壁水珠。 ?、迣⑸弦徊襟E所得溶液和絮狀沉淀均加至吸附柱中（吸附柱放入廢液收集管中），8000rpm離心1分鐘，棄廢液。 ?、呒尤?00μL漂洗緩沖液1（使用前先檢查是否已加入無水乙醇），8000rpm離心1分鐘，棄廢液。 ?、嗉尤?00μL 漂洗緩沖液2（使用前先檢查是否已加入無水乙醇），最大轉速13000rpm離心3min，棄廢液。 ?、釋⑽街呕貜U液收集管中，最大轉速13000rpm離心1分鐘，盡量去除漂洗液。 ?、鈱⑽街D入一根干凈的離心管中(需自行準備，試劑盒中未提供)，加入50μL洗脫緩沖液或滅菌去離子水，室溫放置2-5分鐘，8000rpm離心1分鐘。收集濾出液，做好標記，4℃或-20℃（短期）保存備用，-70℃長期保存。 ?。?）核酸檢測：實時熒光定量PCR（qPCR）方法檢測猴痘病毒核酸（PCR實驗室進行）。 ?、俜磻w系的準備：每孔20μL，加入5μL樣本DNA，共計25μL；每次PCR反應，除檢測標本外，應加無DNA對照（用水代替DNA）、陽性對照；所有樣本，包括對照，應設復孔。
?、诩訕? 每根反應管中加入核酸或對照各5uL，蓋緊管蓋或封好透明膜，置于熒光定量PCR檢測儀上。
?、軆x器檢測通道選擇:使用熒光定量PCR檢測儀，選擇Fam熒光信號檢測通道，收集設在60℃。具體設置方法參照各儀器使用說明書。 ?、萁Y果分析閾值設定:使用熒光定量PCR檢測儀進行結果分析時，基線取3-10或6-15個循環的熒光信號，閾值設定原則為閾值線剛好超過正常陰性對照擴增曲線最高點，也可根據儀器噪音情況調整閾值。 ?、賀eal-time PCR反應系統的質量控制:反應結果應同時符合以下2個條件，否則試驗結果無效，應重新開展檢測。陰性對照無擴增，為陰性。陽性對照未出現陰性結果。 所有陽性和處于灰區的標本應重復檢測或經序列分析進行確診。需注意：當標本僅為咽拭子或血清、血漿，且檢測結果為陰性時，應結合臨床癥狀，慎重做出陰性診斷。 做好熒光定量實時PCR方法檢測猴痘病毒核酸原始記錄。 1.測序標本選取原則。本土疫情中的首發或早期病例、與早期病例有流行病學關聯的關鍵病例、感染來源不明的本土病例、境外輸入病例陽性標本等。以上標本在核酸熒光定量PCR檢測Ct值≤32時進行測序（關鍵樣本除外）。 2.測序要求。以省為單位確定開展猴痘病毒全基因組測序的機構。建議使用擴增子技術進行猴痘病毒全基因組測序。測序數據經質控合格后方可用于后續生物信息分析。二代測序平臺覆蓋深度應不低于10×，三代測序平臺覆蓋深度應不低于50×，全基因組測序覆蓋度應不低于98%。數據比對分析推薦參考猴痘基因組NC_063383.1。 各省應建立本省輸入、本土病例猴痘病毒基因組數據庫，應具備序列對比分析能力。具備測序條件的省份要在接收標本后48小時內開展測序工作，關鍵樣本要求實驗室收到標本后1周內提供測序結果報告，所有測序原始數據(一般為fastq格式)、組裝序列（一般為fasta格式）和標本序列測定結果報告單（見附件7-2）應在獲得序列48小時內報送中國疾控中心病毒病所進行序列匯總、分析。病毒病所應將序列分析結果及時反饋各省，并將全國猴痘病毒序列匯總、分析結果及時上報國家疾控局。 3.分子分型。推薦使用在線分析工具Nextclade（https:// clades.nextstrain.org）對變異株進行分子分型。
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